Wissen  - Gelfärbung

Gelfärbung

aufgenommen am: December 21, 2010 08:07:18 PM

Für die Auswertung der aufgetrennten Proteine bzw. dem Vergleich der eingesetzten Markerproteine, müssen diese zunächst sichtbar gemacht werden. Hierbei werden unterschiedliche Farbstoffe im Laboralltag zum Einsatz kommen. Diese müssen verschiedenen Anforderungen entsprechen, wie einer hohen Empfindlichkeit und einer ebenso guten Reversibilität, damit eventuelle nachfolgende Analysen uneingeschränkt gewährleistet werden. Weiterhin sollte die Intensität der Farben nicht unterschiedlich ausfallen bei verschiedenen Aminosäuresequenzen mit gleich hoher Konzentration. Ebenfalls sollte zwischen der Farbintensität und der Konzentration der Proteine eine Proportionalität vorherrschen.

Auf dem Markt befinden sich für die Gelelektrophorese einige Proteinfarbstoffe, die diesen Voraussetzungen lediglich unvollständig bzw. im eingeschränkten Maß gerecht werden. Einer der gebräuchlichsten Farbstoffe ist Coomassie Blau, der in der Anwendung einfach und zeitsparend ist. Jedoch reicht mit 200ng/Bande die Empfindlichkeit oft nicht aus. Zwar kann die Silberfärbung, oder auch Silverstain, durch eine hohe Nachweisempfindlichkeit bzw. Sensitivität von etwa 1-5 ng/Bande überzeugen, jedoch ist die Färbeanweisung doch äußerst zeitaufwändig und kompliziert. Es ist schwer zu reproduzieren und auch kaum zu quantifizieren. Hierbei werden unterschiedliche Proteine in der gleichen Anzahl mit verschiedener Farbintensität angefärbt, jedoch ist die Fixierung selbiger zum Teil nicht mehr umkehrbar, somit sind Massenspektroskopie und Blotten nur kaum denkbar. Ein Großteil der Anforderungen wird von den floureszierenden SYPRO-Farben, die auch von dem Unternehmen Biostep angeboten werden, erfüllt. SYPRO Ruby ist zum Teil in der Empfindlichkeit fast wie die Silberfärbung, jedoch schwer entfärbbar, im Allgemeinen jedoch empfindsamer als Coomassie.

Von Vorteil sind sie besonders wegen der Linearität in Bezug auf die Proteinmenge sowie der Farbintensität und reichen über drei bis vier Größenordnungen. SYPRO Ruby setzt sich allerdings aus dem als krebserregend geltenden Ruthenium zusammen. Alle Vorteile werden in den SYPRO-Farben von Biostep vereinigt, jedoch nicht die Nachteile, da sie alle besser als Coomassie färben. Im sichtbaren Bereich färbt AmphieBlue. Fluoreszenzfarbstoffe sind AmphieRed Fluo, wobei dies höher empfindlich ist als SYPRO Ruby, und Visopt AmphiGreen Fluo und beide sind vergleichbar mit der Proportionalität von SYPRO Ruby. Mit einem Transilluminator wird die Fluoreszenz angeregt. Diese drei Farbstoffe beeinflussen keine eventuellen anschließenden Untersuchungen.

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